Молекулярно-генетическое тестирование предназначено для выявления генетических изменений внутри клеток, которые служат причинами возникновения злокачественных опухолей. Сейчас этот метод исследования является неотъемлемой частью лечения пациентов с раком.

Как развивались молекулярно-генетическое тестирование и онкогенетика

Молекулярно-генетическое тестирование активно используют в онкогенетике. Этот раздел медицины изучает связь опухолей с изменениями в генах. О злокачественных заболеваниях знали еще в Древней Греции во времена Гиппократа, но к пониманию их причин и роли генетических поломок врачи пришли только в XX веке1.

В начале прошлого столетия немецкий биолог Теодор Бовери предположил, что злокачественное перерождение клеток может происходить в результате генетических аномалий2. В дальнейшем ученые увидели, что генетический материал тканей опухолей действительно отличается от обычного. В то время генетикам был доступен только микроскоп, поэтому сначала обнаружили крупные «поломки», такие как изменение количества хромосом. Это состояние называется анеуплоидия, и оно часто встречается при злокачественных новообразованиях3.

В 1953 г. Джеймс Уотсон и Френсис Крик открыли двойную спираль молекулы ДНК4. И это дало толчок развитию биологии и, в частности, генетики. Поистине революционным для онкогенетики стал конец XX века. Появилось понятие онкогенов. В здоровых клетках они не влияют на деление и гибель, но в результате определенных мутаций становятся активными и начинают влиять на эти процессы в опухолевых клетках5. Антионкогены (онкосупрессоры) в норме сдерживают неконтролируемое деление или способствуют гибели таких клеток5. Из-за мутаций в онкогенах и антионкогенах клетки становятся злокачественными, их бесконтрольное размножение приводит к росту опухоли5.

Люди поняли, что рак — это многофакторное заболевание, и в нем очень велика роль генетических изменений6. Поэтому на стыке онкологии, генетики и молекулярной биологии появилось новое направление молекулярной медицины — онкогенетика.

Проект «Геном человека» — важный шаг в изучении природы рака

В 1990 г. в США стартовал беспрецедентный по масштабу научно-исследовательский проект под названием "Геном человека"7. Ученые поставили цель полностью расшифровать геном. Это помогло бы глубже проникнуть в природу злокачественных новообразований, дало бы ключ к лечению и возможность полной победы над раком. Последние 8% генома специалисты расшифровали в начале 2022 г.

В 2006 г. Национальный институт по изучению рака совместно с Институтом по исследованию генома человека (США) запустили научно-исследовательский проект «Атлас генома человека»8. Задачей было выявить, тщательно изучить и систематизировать генетические мутации, которые ведут к развитию рака. За 12 лет ученые изучили генетические профили опухолей более 11 тысяч пациентов с разными типами рака и подробно проанализировали 33 вида злокачественных новообразований.

Знания постоянно пополняются, результаты исследований публикуют в базе данных COSMIC9. Это самый большой банк данных генетических поломок (мутаций) при злокачественных опухолях, он доступен онлайн.

Почему важно знать генетический профиль опухоли

Успехи в расшифровке генома опухолей открыли перед исследователями путь к разработке новых эффективных методов лечения рака. Они стали предпосылками к появлению прицельного лечения рака, то есть методов, направленных точно и специфично на конкретный вид новообразования. Онкотерапия становится все более и более персонализированной: теперь пациенту может быть доступно лечение, подходящее именно ему, то есть максимально эффективное при конкретной опухоли1. В опухолевых клетках встречаются самые разнообразные генные мутации10. Современные методы молекулярно-генетического анализа, в том числе комплексное геномное профилировани (КГП)1, 11, позволяют с высокой точностью обнаруживать все виды мутаций. Как результат, лечащему врачу становится доступна уникальная генетическая картина опухоли у конкретного пациента.

Какие методы используют для выявления мутаций в клетках опухоли

Для обнаружения изменений, свойственных клеткам злокачественных опухолей, используют разные методы молекулярно-генетического тестирования. Давайте рассмотрим, какие можно использовать для диагностики рака.

Иммуногистохимическое исследование

Самое распространенное иммуногистохимическое исследование (ИГХ) используют уже несколько десятилетий12. Несмотря на некоторые ограничения, оно продолжает играть важную роль при постановке онкологического диагноза.


При ИГХ в образце ткани обнаруживают белки, специфичные для того или иного типа опухоли. Это позволяет отличать их друг от друга. Также ИГХ дает возможность определить чувствительность опухоли к действию разных лекарств.

Флуоресцентная гибридизация in situ (метод FISH)

Особенность метода FISH в том, что образец ткани опухоли обрабатывают специальными реактивами с так называемыми ДНК-зондами. Это определенные нуклеотидные последовательности (фрагменты ДНК), окрашенные с помощью флуоресцентного красителя. Они связываются только с соответствующими участками ДНК в клетках исследуемого образца ткани. Характерное свечение позволяет увидеть их под флуоресцентным микроскопом13.

Для разных генетических аномалий нужны разные, специфичные для них ДНК-зонды. Это одно из ограничений метода FISH.

А вот преимущество — в том, что его можно использовать на неделящихся клетках. А значит, он подходит для тканей опухолей с невысокой скоростью клеточного деления. Например, этим методом можно изучать опухоли плотной структуры — солидные (от английского solid — твердый), которые не относятся к опухолям крови. Для диагностики опухолей крови FISH-метод тоже подходит. Словом, флуоресцентная гибридизация in situ помогает различать злокачественные и доброкачественные опухоли разных органов и тканей13.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Принцип полимеразной цепной реакции (ПЦР), в том числе в режиме «реального времени» (real-time), заключается в значительном увеличении количества копий определенных фрагментов ДНК из образца ткани. В миллионах копий одного гена легче обнаружить генетические поломки. При ПЦР копируют только те гены, которые интересны исследователю и отвечают заданным параметрам. За счет этого метод обладает высокой чувствительностью13.

Метод ПЦР используют сам по себе или в комплексе с другими молекулярно-генетическими исследованиями для высокой точности.

В современных лабораториях ПЦР часто применяют не только для диагностики злокачественных опухолей, но и при целом ряде других заболеваний. При инфекциях с его помощью можно обнаружить даже единичных возбудителей13.

Методика ПЦР активно развивалась в период существования программы «Геном человека». За создание технологии ПЦР, оказавшей столь большое влияние на развитие онкогенетики, американский биохимик Кэри Муллис (Kary Mullis) в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии14.

В дальнейшем появились современные методы секвенирования, то есть расшифровки нуклеотидных последовательностей в структуре ДНК. Благодаря этому ученые смогли накопить колоссальную базу данных о строении ДНК разных биологических объектов, в том числе опухолей.

Секвенирование нового поколения — будущее онкогенетики

Все методики, описанные выше, несмотря на свои преимущества, имеют одно существенное ограничение. Они позволяют обнаруживать за один раз лишь ограниченное количество молекулярно-генетических изменений. Исследователю нужно заранее знать, какое изменение предполагается, чтобы нацелиться на него. А если природа предполагаемой поломки неизвестна, то ее можно упустить.

Этого недостатка лишена одна из самых современных технологий генетического тестирования: секвенирование нового поколения (next generation sequencing, NGS)15.

С помощью универсального метода NGS можно в полном масштабе изучить абсолютно любую генетическую последовательность. Одновременно можно проанализировать тысячи «кусочков» ДНК, а значит выявить все имеющиеся генетические поломки.

Технология обладает высокой чувствительностью и специфичностью, вероятность постановки неправильного диагноза минимальна16.

Технология NGS относительно молодая: появилась чуть больше 10 лет назад. Она стала технологическим прорывом в генетическом тестировании и превзошла традиционные методики. Сейчас NGS успешно используют для диагностики врожденных заболеваний, злокачественных опухолей и целом ряде других состояний, в которых мутации генов играют ведущую роль.

Ученые смогли значительно продвинуться в понимании природы некоторых видов рака. Так, раньше рак легкого делили только на мелкоклеточный и немелкоклеточный, и в зависимости от этого выбирали лечение. Поэтому лечение не было прицельным (таргетным)5 и не всегда помогало. После открытия множества генетических изменений при раке легкого стало понятно, почему одни опухоли чувствительны к тому или иному лечению, другие — нет. NGS позволяет подобрать персональное лечение для пациента.

Полногеномное и полноэкзомное секвенирование

Технология NGS позволяет исследовать весь геном человека, то есть совокупность абсолютно всех генов. Это так называемое полногеномное секвенирование. Оно помогает выявить, есть ли у человека наследственная предрасположенность к опухолям (важно при диагностике наследственных опухолевых синдромов)17. Полное секвенирование генома также используют в случаях, когда другие методы диагностики не выявили генетическую причину рака. Однако чаще проводят полноэкзомное секвенирование. Под экзомом понимают совокупность участков генов (экзонов), которые отвечают за синтез тех или иных белков. На экзом приходится лишь совсем крошечная часть генома, однако именно мутации в нем часто вызывают развитие злокачественных опухолей.

Эти методы редко используют на практике из-за дороговизны, и потому что они дают врачу избыточно много информации, что усложняет принятие решений.

NGS-панели

Для молекулярно-генетической диагностики применяют NGS-панели (или таргетные панели генов), специально разработанные для определенных видов болезней, включая онкологические. Преимущество в том, что можно прицельно изучить определенные группы (панели) генов, поломки в которых провоцируют развитие той или иной патологии.

Этот вид исследования наиболее информативен для диагностики злокачественных новообразований. Подробное изучение генома позволяет выявить все мутации для конкретной опухоли. А значит у пациента появляется возможность получить индивидуализированное таргетное лечение5.

Комплексное геномное профилирование как инновация XXI века

Достижения в области молекулярно-генетического тестирования успешно реализуются в комплексном геномном профилировании (КГП) методом секвенирования нового поколения. Она дает наиболее глубокую и четкую картину мутаций, поскольку позволяет проанализировать за один раз сотни генов, изменения в которых могут стать причиной развития рака15,18. На основании полученных результатов врач может точно подобрать противоопухолевый препарат.

КГП выявляет намного больше генетических поломок, чем стандартные методы тестирования. Например, при раке легкого этим методом выявляют на 17% больше пациентов с мутациями гена EGFR, чем традиционными методами генетического тестирования (FISH и ПЦР)19.

При меланоме (одной из самых агрессивных злокачественных опухолей) КГП обнаруживает на 37% больше пациентов с изменениями гена BRAF — частой причиной этого заболевания20.

КГП значительно повлияло на подход к лечению пациентов со злокачественными новообразованиями. Так, в случае аденокарциномы легкого молекулярно-генетическое исследование меняет подход к лечению примерно у половины пациентов и существенно повышает его эффективность21.


Кроме этого КГП подходит для определения двух параметров, важных для некоторых опухолей. Это мутационная нагрузка опухоли и микросателлитная нестабильность.

Мутационная нагрузка опухоли (TMB, tumor mutational burden) показывает общее число генных мутаций внутри злокачественной клетки22. Микросателлитная нестабильность (MSI, microsatellite instability) — показатель, характеризующий генетическую изменчивость опухолей.

Заключение

Медицина XXI века стремительно движется вперед, раскрывая причины и механизмы развития болезней. Развитие методов молекулярно-генетического тестирования открыло новую страницу в онкологии. Точная диагностика и прицельное лечение повышают шансы на успех в борьбе с раком. Комплексное геномное профилирование позволяет персонализировать лечение пациентов, сделать его более эффективным и улучшает прогноз.

M-RU-00011849 Май, 2023

Список литературы:

  1. История развития онкогенетики. Информационный портал о генетике Genetics Info. Электронный ресурс. URL: https://genetics-info.ru/blogs/istoriya-razvitiya-onkogentiki-/ (дата обращения 22.10.2022).
  2. Maayan, Inbar, "Theodor Heinrich Boveri (1862-1915)". Embryo Project Encyclopedia (2011-03-03). ISSN: 1940-5030 Электронный ресурс. URL: http://embryo.asu.edu/handle/10776/1690 (дата обращения 22.10.2022).
  3. Weaver, B. A., & Cleveland, D. W. (2006). Does aneuploidy cause cancer? Current Opinion in Cell Biology, 18(6), 658–667. doi:10.1016/j.ceb.2006.10.002
  4. Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик. Биография. Источник: https://biographe.ru/uchenie/uotson-i-krick (дата обращения 22.10.2022)
  5. Генетика и онкология: главные вопросы. ФГБУ НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова Минздрава РФ. Электронный ресурс. URL: https://nii-onco.ru/diagnostika/genetika-i-onkologiya-glavnye-voprosy/ (дата доступа 21.10.2022)
  6. Белушкина Н.Н., Чемезов А.С., Пальцев М.А. Генетические исследования мультифакториальных заболеваний в концепции персонализированной медицины. Профилактическая медицина. 2019;22(3):26‑30. https://doi.org/10.17116/profmed20192203126
  7. Nicolas Altemose, Glennis A. Logsdon, Andrey V. Bzikadze et al. Complete genomic and epigenetic maps of human centromeres, Science, 376, 6588, (2022). /doi/10.1126/science.abl4178
  8. The Cancer Genome Atlas Program. National Cancer Instituteat the National Institutes of Health. Электронный ресурс. URL: https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga (дата обращения 21.10.2022)
  9. Forbes S.Aю, Beare D., Gunasekaran P. et al. COSMIC: exploring the world's knowledge of somatic mutations in human cancer. Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43(Database issue):D805-11. doi: 10.1093/nar/gku1075. Epub 2014 Oct 29. PMID: 25355519; PMCID: PMC4383913.
  10. Stratton, M., Campbell, P. & Futreal, P. The cancer genome. Nature 458, 719–724 (2009). https://doi.org/10.1038/nature07943.
  11. Молекулярная диагностика рака. Информация для пациентов. НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова. Электронный ресурс. URL: https://www.niioncologii.ru/patients/additional-information/molecular-diagnostics(дата доступа 20.10.2022).
  12. De Matos LL, Trufelli DC, De Matos MGL, Da Silva Pinhal MA. Immunohistochemistry as an Important Tool in Biomarkers Detection and Clinical Practice. Biomarker Insights. 2010;5. doi:10.4137/BMI.S2185
  13. George J. Netto, Rana D. Saad & Peter A. Dysert II (2003) Diagnostic Molecular Pathology: Current Techniques and Clinical Applications, Part I, Baylor University Medical Center Proceedings, 16:4, 379-383, DOI: 10.1080/08998280.2003.11927931
  14. Kary B. Mullis. Biographical. Электронный ресурс. URL: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/1993/mullis/biographical/ (дата обращения 23.10.2022)
  15. Frampton, G., Fichtenholtz, A., Otto, G. et al. Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing. Nat Biotechnol 31, 1023–1031 (2013). https://doi.org/10.1038/nbt.2696
  16. Koboldt, D.C. Best practices for variant calling in clinical sequencing. Genome Med 12, 91 (2020). https://doi.org/10.1186/s13073-020-00791-w
  17. Family Cancer Syndromes. Genetics and cancer. Written by The American Cancer Society medical and editorial content team. Last Revised: August 5, 2020. Электронный ресурс. URL: https://www.cancer.org/healthy/cancer-causes/genetics/family-cancer-syndromes.html (дата доступа 01.09.2022)
  18. FoundationOne® Technical Specifications (2017) Электронный ресурс. URL:www.foundationmedicine.com/genomic-testing/foundation-one (дата доступа 1.09.2022).
  19. Alexa B. Schrock; Garrett M. Frampton; Dana Herndon. Comprehensive Genomic Profiling Identifies Frequent Drug-Sensitive EGFR Exon 19 Deletions in NSCLC not Identified by Prior Molecular Testing. Clin Cancer Res (2016) 22 (13): 3281–3285. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-15-1668
  20. Boussemart L, Nelson A, Wong M et al. Hybrid Capture-Based Genomic Profiling Identifies BRAF V600 and Non-V600 Alterations in Melanoma Samples Negative by Prior Testing. Oncologist. 2019 May;24(5):657-663. doi: 10.1634/theoncologist.2018-0271. Epub 2019 Jan 25. PMID: 30683711; PMCID: PMC6516121.
  21. Rozenblum AB, Ilouze M, Dudnik E, Dvir A, Soussan-Gutman L, Geva S, Peled N. Clinical Impact of Hybrid Capture-Based Next-Generation Sequencing on Changes in Treatment Decisions in Lung Cancer. J Thorac Oncol. 2017 Feb;12(2):258-268. doi: 10.1016/j.jtho.2016.10.021. Epub 2016 Nov 16. PMID: 27865871.
  22. Tumor mutational burden. NCI Dictionary definition. Электронный ресурс. URL:https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/tumor-mutational-burden (дата обращения 21.10.2022)
  23. Microsatellite instability. NCI Dictionary definition. Электронный ресурс. URL:https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/microsatellite-instability (дата обращения 21.10.2022)